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建立可吸收醫用膜細菌內毒素檢查的新方法

  張逸,魯雙雲,高文娟,劉揚,潘立群,何紅,顧海鷹

  摘要:【目的】檢驗粘克TM可吸收醫用膜是否符合生物材料的熱原要求,建立粘克TM可吸收醫用膜的細菌內毒素檢查方法。【方法】按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄及GB/16175一1996規定,同時采用熱原檢查法和細菌內毒素檢查法對粘克TM可吸收醫用膜72h的浸提液樣品進行檢測。【結果】該浸提液對細菌內毒檢測不產生幹擾,細菌內毒素試驗結果為陰性。同時受試家兔體溫升高均低於0.6℃,並且3隻家兔體溫升高總和低於1.4℃。【結論】粘克TM可吸收醫用膜不含引起機體發熱的內毒素或致熱原,符合醫用生物材料的使用標準。用細菌內毒素檢查法替代家兔熱原法對該可吸收膜進行熱原檢查是可行的。

  關鍵詞:粘克TM可吸收醫用膜;家兔熱原試驗;內毒素試驗

  作為評價醫用生物材料生物學安全性指標之一的熱原試驗和細菌內毒素試驗是檢測其是否含有引起機體發熱的致熱原或內毒素的方法。熱原試驗能夠全麵檢出內毒素所致或非內毒素所致的熱原物質,而內毒素試驗是利用賞的變形細胞與微量內毒素產生凝集反應的現象,作為判斷樣品中細菌內毒素限量是否符合規定的一種方法。與家兔熱原試驗相比,它具簡便、快速、靈敏度高、重現性好等優點。內毒素試驗一般隻用於某些大液體熱原的檢查。本文依照《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XID,XIE及GB/T16175一1996的標準要求,同時用熱原檢查法和細菌內毒素檢查法對粘克TM可吸收醫用膜進行檢測,研究能否用細菌內毒素試驗替代家兔熱原試驗進行熱原檢測,以建立能夠快速檢測該可吸收醫用膜內毒素的檢查方法。

  1材料與儀器

  1.1 試劑

  細菌內毒素檢查用水(BET水):批號:060315規格:5

  細菌內毒素工作標準品(RES):批號:2006一4 規格:160EU/支廠家:中國藥品生物製品檢定所

  鱟試劑:批號:0602210 規格:0.25EU/ml,0.lml/支 廠家:湛江博康海洋生物有限公司。

  1.2樣品

  粘克TM可吸收醫用膜: 批號:02010406 規格:140mmx60mm,批號:03010626 規格:50mmx50mm 廠家:啟東致遠生物科技有限公司(即現在由上海赌博游戏醫療科技有限公司生產的粘克TM可吸收醫用膜)

  1.3儀器

  電熱恒溫熱鼓風幹燥箱,型號:101AB-Z(上海華聯環境試驗設備公司恒昌儀器廠),潔淨工作台,型號:HS-1300(蘇州安泰空氣技術有限公司),旋渦混合器,型號:XW-80A(上海醫科大學儀器廠)。

  1.4實驗動物

  1.9-2.8kg家兔,由南通大學實驗動物中心提供。

  2方法

  2.1試驗準備

  試驗所用器材,經180℃烘烤3h以上除去可能存在的外源內毒素。

  2.2粘克哪可吸收醫用膜浸提液的製備閣

  將同一批號的粘克側可吸收醫用膜切成30mmx5mm條狀,置於去熱原的25ml錐形瓶中,按受試材料6cm2::1ml氯化鈉注射液的比例,取14ml氯化鈉注射液於錐形瓶中,置於37℃電熱恒溫培養箱中浸提72h。72h後將浸提液轉移至另一去熱原的錐形瓶中,調節pH值為7.0左右,4℃保存備用。以上過程均在潔淨工作台上按無菌操作要求進行。

  2.3鱟試劑靈敏度的複核

  按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XIE細菌內毒素檢查法複核鱟試劑靈敏度,結果見表1。所用上述批號鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml,其靈敏度符合規定,可用於試驗。

  表一 靈敏度複核結果

批號 細菌內毒素濃度(EU/ml) 陰性對照 λ
0.5 0.25 0.125 0.0625
0602210 ++++ ++++ ++++ ---- -- 0.125

  2.4幹擾預試驗

  取醫用膜浸提液,以BET水製成10倍、50倍、100倍係列稀釋溶液,用此係列溶液及浸提液原液作溶劑,溶解並稀釋內毒素,以製成含細菌內毒素工作標準品2入和0.25入兩個濃度的內毒素溶液,用靈敏度為0.25EU/m1的賞試劑進行試驗,同時作陽性和陰性對照。

  2.5幹擾試驗

  按《中華人民共和國藥典》進行幹擾試驗。分別用BET水及浸提液原液將內毒素配製成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625EU/ml的溶液,同時用BET水和浸提液原液各做2管陰性對照,用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行試驗。

  2.6樣品檢測

  取醫用膜浸提液原液,按中國藥典進行內毒素檢查試驗。

  2.7熱原檢查法

  根據GB/T16175-1996熱原試驗,在試驗前7d選3隻家兔,雌雄不限,雌兔無孕,且測溫前7d內應在同一環境條件用同一飼料飼養,在此期間家兔體重無減輕,精神、食欲、排泄等無異常。預測體溫時用肛溫計插人家兔肛門,深度約6cm,時間為2min,取出肛溫計並記下讀數。每隔lh測量1次,共測4次,體溫均在38.0℃-39.6℃的範圍內,且最高最低體溫的差數不超過0.4℃,符合熱原試驗要求。

  3d後將家兔固定於固定器內。30min後開始第1次測量,以後每隔30min測1次,共測3次。體溫之差不超過0.2℃,以此3次體溫的平均值為該兔的正常體溫。且當日使用家兔的體溫在38.0℃一39.6℃的範圍內,各兔間正常體溫之差不超過1℃。在家兔正常體溫符合要求後15min內,自耳靜脈緩慢注人預熱38℃醫用膜浸提液,劑量為10m/kg。注射後每隔lh測量體溫1次,3次體溫中最高的1次減去正常體溫為試驗家兔體溫升高值,結果見表4。

  3結果與討論

  該醫用膜浸提液的原液和稀釋10倍、50倍、100倍液對細菌內毒素試驗均不產生幹擾作用(見表2)。用原液做幹擾試驗,得到譽試劑Es值為0.125,在0.5λ~2λ範圍內。Et分別為0.18和0.125,在0.5-2.OEs範圍內,因此認為醫用膜的浸提原液對內毒素試驗不產生幹擾(見表3)。

  表二 幹擾預試驗的測定結果

樣品批號 係列 稀釋倍數 陽性對照 陰性對照
原液 10倍 50倍 100倍
02010406 樣品陰性對照 -- -- -- -- ++ --
樣品陽性對照 ++ ++ ++ ++
03010626 樣品陰性對照 -- -- -- -- ++ --
樣品陽性對照 ++ ++ ++ ++

  表三幹擾試驗結果

樣品批號 係列 細菌內毒素濃度(EU/ml 陽性對照 陰性對照 靈敏度E(EU/ml)
0.5 0.25 0.125 0.0625

BET水 ++++ ++++ ++++ ---- ++ -- 0.125
02010406 樣品 ++++ ++++ +--+ ---- ++ -- 0.18
03010626 樣品 ++++ ++++ ++++ ---- ++ -- 0.125

  表四可吸收醫用膜細菌內毒素檢查結果

樣品批號 樣品管 樣品陽性對照管(2λ) 陰性對照管 陽性對照管(2λ)
02010406 -- ++ -- ++
03010626 -- ++ -- ++

  通過表4的內毒素檢查結果可見該醫用膜的細菌內毒素檢查是符合規定的。同時用家兔進行熱原試驗,由表5可見,3隻家兔體溫升高均低於0.6℃,並且3隻家兔體溫升高總和低於1.4℃,熱原檢查符合規定,與細菌內毒素檢查法結果一致。

  表五 熱原試驗結果

批號 兔號 體重(kg) 注射前體溫(℃) 注射前體溫(℃) 體溫升高值 結論
第1次 第2次 第3次 第1次 第2次 第3次
02010406 1 2.6 39.5 39.5 39.6 39.6 39.5 39.6 0.1 合格
2 2.4 39.4 39.5 39.5 39.5 39.4 39.5 0.0
3 2.3 39.1 39.1 39.1 39.4 39.4 39.2 0.3
03010626 1 2.4 39.2 39.2 39.2 39.4 39.2 39.4 0.2 合格
2 2.3 39.5 39.5 39.3 39.2 39.2 39.1 0.0
3 2.4 39.4 39.3 39.3 39.2 39.1 39.2 0.0

  4結論

  本試驗同時用細菌內毒素檢查法和熱原檢查法檢查粘克哪可吸收醫用膜是否含有引起機體發熱的內毒素或致熱原。兩種方法的檢查結果一致,均為陰性,因此判定該醫用膜不含引起機體發熱的內毒素或致熱原,符合醫用材料的使用標準。同時說明用細菌內毒素檢查法替代家兔熱原法對該可吸收醫用膜進行熱原檢查是可行的。

  參考文獻:

  【1】中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社,2005.附錄XIE,85一88.

  【2】中國標準出版社第一編輯室.GB理16175一1996醫用有機矽材料生物學評價試驗方法[S].北京:中國標準出版社,2003:熱原試驗,16一17.

  【3】中國標準出版社第一編輯室.GB理16886.12一20(X]醫療器械生物學評價[S].北京:中國標準出版社,2003:第12部:樣品製備與參照樣品,191一192.

  (收稿日期:2006-11-20)

  選自《現代預防醫學》2007年第34卷第18期